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產(chǎn)品說(shuō)明：

使用說(shuō)明：

作用機(jī)理

Blasticidin S是一種來(lái)自Streptomyces griseochromogenes的核苷類(lèi)抗生素，通過(guò)干擾核糖體中肽鍵的形成來(lái)特異性地抑制原核和真核生物的蛋白質(zhì)合成。Blasticidin S用于篩選攜帶有bsr或BSD耐受基因的轉(zhuǎn)染細(xì)胞。殺稻瘟菌素具有快速而強(qiáng)效的作用模式，很低的抗生素濃度便能導(dǎo)致細(xì)胞迅速死亡。

抗性基因

目前已經(jīng)克隆和測(cè)序的殺稻瘟菌素耐受基因有3種，一種是分離自產(chǎn)生菌Streptoverticillum sp.的乙?；D(zhuǎn)移酶基因bls，另外兩種是脫氨酶基因，包括從Bacillus cereus 中分離的bsr和從Aspergillus terreus 中分離的BSD 基因。Bsr和 BSD 基因是最常用的篩選標(biāo)志，用于哺乳動(dòng)物和植物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)，也可用于E.Coli。

篩選濃度

1）Escherichia coli

E. coli對(duì)Blasticidin S的敏感性稍差，但是轉(zhuǎn)化子對(duì)Blasticidin S具有耐受性，可以用低鹽LB培養(yǎng)基（pH 8）進(jìn)行篩選，濃度范圍為50-100 μg/mL Blasticidin S。高pH值可以提高Blasticidin S的活性。

2）哺乳動(dòng)物細(xì)胞

哺乳動(dòng)物細(xì)胞中Blasticidin S的工作濃度范圍在1-50 μg/mL。初次實(shí)驗(yàn)建議通過(guò)滅殺曲線來(lái)確定最佳使用濃度。

一些哺乳動(dòng)物細(xì)胞建議工作濃度

實(shí)驗(yàn)步驟

Blasticidin S通常使用濃度為10 μg/mL。攜帶bsr或BSD基因的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，在含有Blasticidin S的正常生長(zhǎng)培養(yǎng)基中孵育，用于篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

1）轉(zhuǎn)染后48h，用含有適宜濃度Blasticidin S的新鮮培養(yǎng)基將細(xì)胞傳代（注：細(xì)胞處于活躍分裂期時(shí)抗生素工作最好。細(xì)胞密度太高，抗生素效率降低。細(xì)胞分盤(pán)時(shí)覆蓋率最好不超過(guò)25%）。
2）每3-4天去除培養(yǎng)基，加入含抗生素的新鮮培養(yǎng)基。

3）7天后檢測(cè)細(xì)胞集落形成。根據(jù)宿主細(xì)胞種類(lèi)和轉(zhuǎn)染/篩選效率，集落形成可能需要增加一周或更久。

4）轉(zhuǎn)移5-10個(gè)耐受克隆到35 mm細(xì)胞盤(pán)中，加入選擇培養(yǎng)基維持培養(yǎng)7天。隨后用細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。

注意事項(xiàng)：

本產(chǎn)品僅供科研使用，不可用于臨床診斷應(yīng)用或其他用途。