什么是二抗？

二抗是在其它宿主體內(nèi)制備的能與一抗或一抗片段結(jié)合的抗體，上面通常連有酶或熒光素等標(biāo)簽。由于二抗所具備的優(yōu)點使得其在免疫學(xué)實驗中得以應(yīng)用廣泛，如western blot（通過與特異性抗體結(jié)合來鑒定蛋白質(zhì)），ELISA（以耦聯(lián)有酶的抗體或抗原為標(biāo)記來檢測特異性的蛋白質(zhì)，尤其是相應(yīng)的抗原或抗體），免疫組織化學(xué)（檢測組織中的特異性抗原），免疫細(xì)胞化學(xué)（通過免疫學(xué)方法檢測細(xì)胞的抗原組成），流式細(xì)胞術(shù)（通過檢測激光所激發(fā)熒光來鑒定分離不同類型的細(xì)胞）及免疫沉淀（通過抗原與抗體的特異性結(jié)合作用來分離相應(yīng)抗原）。

使用二抗的優(yōu)勢？

二抗針對某一特定物種（如小鼠）的所有抗體均具有特異性，因而使用標(biāo)記的二抗可以免去對每一個一抗進(jìn)行標(biāo)記，大大節(jié)省了時間和費用；此外，一個一抗分子可以同時結(jié)合幾個二抗分子，從而使信號大大增強(qiáng)，提高了實驗靈敏度。二抗可以耦聯(lián)有幾種不同的標(biāo)記，可以是酶，熒光素，或生物素。

如何選擇二抗？

檢測任何目的靶蛋白都有不止一種抗體可供選擇，同時在后繼試驗中也會有不同的檢測方案，因此在選擇二抗的時候要綜合考慮一抗的類型及后繼檢測方案的要求，其中如何根據(jù)一抗的種屬來源和類型選擇二抗尤為重要。小編根據(jù)以往的經(jīng)驗整理了一下選擇的要點：

1. 一抗的種屬來源

二抗應(yīng)選用與使用的一抗相同的物種來源，例如：如果你的一抗是小鼠源的單克隆抗體，二抗則選抗小鼠的二抗（山羊抗小鼠或者兔抗小鼠等均可）；如果一抗是從兔血清里制備的兔源多克隆抗體，則相應(yīng)的二抗需要選擇抗兔的二抗。即根據(jù)一抗的物種來源選擇相應(yīng)的抗該物種的二抗。

2. 一抗是屬于哪個類或亞類

除了要與一抗的種屬來源相一致，二抗還需與一抗的類別或亞類相匹配，這通常是針對單克隆抗體而言。一般來說多克隆抗體主要是IgG類免疫球蛋白，因此相應(yīng)的二抗就是抗IgG抗體。而單克隆抗體則相對復(fù)雜些，由于單克隆抗體有不同的類別和亞型，因此相應(yīng)的二抗也需要根據(jù)這些亞型進(jìn)行選擇。

單克隆抗體的類別及亞類通常會在產(chǎn)品說明書中都會有描述，如果您的一抗是小鼠IgM，那么相應(yīng)的二抗就應(yīng)當(dāng)是抗小鼠IgG抗體。如果單克隆一抗是小鼠 IgG的某一亞類（IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3），那么幾乎所有的抗小鼠IgG都可以與之結(jié)合，或者您也可以選擇專門針對這一亞類的二抗，例如，如果您的一抗是小鼠IgG1，那么您可以選擇抗IgG1的二抗，此種抗體在雙標(biāo)記實驗中尤其適合。在不清楚一抗為何種類/亞類的情況下，可以選用抗相應(yīng)物種IgG，因為此種抗體可以識別大多數(shù)類型的IgG免疫球蛋白。

3. 二抗的種屬來源

一般來說，不同的種屬來源與二抗的質(zhì)量沒有必然的聯(lián)系，來源于山羊的二抗與來源于驢的二抗在一般的實驗里沒有太多的差別。然而在一些特殊的實驗里，如雙標(biāo)實驗里，如果其中一個一抗是山羊來源的，一個是小鼠來源的，則相應(yīng)的二抗分別要抗山羊和抗小鼠的二抗，這時候，二抗就不能選擇山羊或者小鼠來源的。選擇相應(yīng)的驢來源的二抗，就非常適合做類似雙標(biāo)的免疫實驗。雙標(biāo)得2個都抗才行，故選擇第3個種源的抗體

4. 選擇哪種形式的二抗，是整個IgG分子，F(ab')2片段，還是Fab片段？

整個IgG分子：此種抗體適用于多數(shù)情況。

F(ab')2片段：該種抗體是由兩個靠二硫鍵連接的用于結(jié)合抗原的Fab片段組成， 這些抗體用在特定的情況中，如需要避免抗體與具有Fc受體的細(xì)胞結(jié)合的情況。

Fab片段：它們只有一個結(jié)合位點，一般用來封閉內(nèi)源性免疫球蛋白。

5. 二抗的耦聯(lián)標(biāo)記

 一般來講，耦聯(lián)到二抗上的探針主要有酶，熒光基團(tuán)（FITC, RRX, TR, PE）和生物素。選用哪種探針的二抗主要取決于具體的實驗。對于western blot和ELISA，最常用的二抗是酶標(biāo)二抗，而細(xì)胞或組織標(biāo)記實驗（細(xì)胞免疫化學(xué)，組織免疫化學(xué)，流式細(xì)胞術(shù)）中通常使用熒光基團(tuán)標(biāo)記的二抗，免疫組化中也可以使用辣根過氧化酶或堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗。如果想要更大程度的放大檢測信號，可以使用biotin/avidin檢測系統(tǒng)。在一些熒光檢測方案中，則需要選擇不同的熒光標(biāo)記；而金顆粒標(biāo)記的二抗則更多的應(yīng)用于免疫電鏡中。

6. 抗體的純度

親和層析純化的抗體一般更受人們歡迎，因為這些產(chǎn)品的純度最高，產(chǎn)生的非特異性背景最少。但是有些情況下也要考慮到純化過程中損失的IgG部分，因為其中含有親和力很高的抗體，尤其是當(dāng)目的抗原存在的量很小的時候，高親和性的IgG部分就顯得尤為重要。

下面總結(jié)了幾種具有不同特異性的二抗

1）針對整個抗體分子（H＋L）具有特異性：

如anti-IgG(H+L)，此類抗體既可以與抗體的重鏈結(jié)合也可以與輕鏈結(jié)合，即與抗體分子的Fc，F(ab')2/Fab部分均可反應(yīng)，anti- IgG(H+L)也可以與其他免疫球蛋白家族反應(yīng)（如IgM和IgA），因為所有的免疫球蛋白都具有相同的輕鏈（κ鏈或λ鏈）。

2）針對Fab片段具有特異性：

這類抗體與重鏈輕鏈均可以結(jié)合，由于它們可以與輕鏈反應(yīng)，它們同時也可以和具有相同輕鏈的其他種類的免疫球蛋白反應(yīng)。

3）針對Fc片段或重鏈具有特異性：

這類抗體和重鏈的Fc部分反應(yīng)，因此它們是類別特異性的。即gamma鏈特異性抗體只與IgG反應(yīng)，mu鏈特異性抗體只識別IgM，依此類推。

4）輕鏈（lambda，kappa）特異性：

與所有類別的抗體反應(yīng)，因為所有類別的抗體均具有相同的lambda鏈或kappa鏈。

5）經(jīng)過吸附處理的二抗：

不同來源的免疫球蛋白含有相似的結(jié)構(gòu)，抗一個物種的抗體可能與其他物種發(fā)生交叉反應(yīng)，因此有些二抗經(jīng)過了動物或人類IgG吸附處理，以減少非特異性背景。 例如，如果是小鼠的組織或細(xì)胞，那么選擇經(jīng)小鼠血清或IgG吸附處理過的二抗可以減少非特異性結(jié)合。但是此種抗體識別表位的數(shù)量被大大減少。